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个最适条件，由于核酸酶的不同，核酸酶在水解核酸时的条件也不相同，所以在已知核糖核酸酶的大体反应条件的情况下，在各条件的附近设计不同水平的正交实验方案。根据不同因素不同水平选用不同的正交实验表，应用正交实验表上的各因素的组合进行实验得出数据，作出各因素的曲线图，若不能确定该因素的最适水平，再继续作未得出结果因素的正交实验，直到得出最适条件。将水解产物加沉淀剂沉淀离心，取上清液，用紫外分光光度计法测260nm处的紫外吸收值。同时用发酵得到的酶液进行正交实验设计，方法与提取酶液水解方法相同。
1。4 核苷酸的结构性质与检测
1。4。1 核苷酸的结构性质
核苷酸是核酸的组成单位，它由三部分组成，分别为磷酸、戊糖和碱基。核苷酸按戊糖的种类不同，可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种，其中核糖核苷酸是rna的组成单位，而脱氧核糖核苷酸则是dna的组成单位。组成rna的核糖核苷酸按照核苷酸分子碱基的不同，核苷酸可以分成四种，即5’-腺嘌呤核苷酸（amp）、5’-鸟嘌呤核苷酸(gmp)，5’-胞嘧啶核苷酸(cmp)和5’-尿嘧啶核苷酸(ump)。
5’-腺嘌呤核苷酸（5’-amp）分子量347。22，自丙酮水溶液中可得含有两分子水的结品。溶于热水，pk3。8(碱性基团)<1，6。2-6。4(磷酸根)。
5’-鸟嘌呤核苷酸（5’-gmp:）分子量363。23，含1/2分子水的结品，pk2。4(碱性基团)、9。4(酸性基团)<1，6。1(磷酸根)。熔点190-200c(分解)。
5’-尿嘧啶核苷酸（5’-ump）分子量324。18，pk9。5(碱基上酸性基团)<1，6。4(磷酸根)。
5’-胞嘧啶核苷酸（5’-cmp)分子量323。21，熔点233c(分解)。pk4。5(碱性基团)<1，6。3(磷酸根)。
四种核苷酸的结构式如下图所示:
实际使用中，四种核苷酸主要以钠盐形式存在。其形态均为无色至自色结晶或白色结晶性粉末，在保藏和应用中多为核苷酸的二钠盐。
1。4。2 核苷酸的检测
核酸水解产物核苷酸、核苷和碱基的分析方法，主要有光谱法（紫外光吸收法）、质谱法、色谱法（高效液相色谱法、离子色谱、反相高效液相色谱（rp-hplc）、薄层色谱）、电泳法（毛细管电泳）等。其中毛细管电泳和高效液相色谱法的分离能力最强，在细胞分离方面有广泛的用途，尤其是高效液相色谱法（hlpc）应用很多，紫外光吸收法应用方便，但准确率不高。离子交换液相色谱法具有较高的分离效率，但是需要对分离柱进行再生，分析的时间较长；反相液相色谱法具有快速、操作方便的特点，现有离子对反相和常规反相色谱，洗脱方法可采用等度洗脱，也可采用梯度洗脱。目前有许多关于核苷酸检测这方面的报道:张志国，贾云虹等用hplc和紫外检测方法对乳粉中的四种核苷酸cmp、ump、amp、gmp含量进行了检测，采用c-18柱，据报道结果完全符合要求。吉琼梅等人用0。05mol/l的kh2po4为流动相的高效液相色谱法测定了棉宝中的5’-amp、5’-cmp、5’-gmp、5’-ump的分解率。黄晓兰、李科德和陈云华报道采用反相高效液相色谱可以分离15种核酸的水解产物，并介绍了该方法在酵母抽提物中的应用。霍小敏、屠春燕等人用反规液相色谱和梯度洗脱模式对酵母rna降解的4中核苷酸进行了分离和检测。郑理、朱怀恩等人用紫外光吸收法对保健品中的核酸含量进行了测定[7]。邹耀洪、曹学增等对以hplc（高效液相色谱）与lc/ms(质谱)复合定性蘑菇柄中的5’-核苷酸进行了报道。韩凤梅、杨新等人对四种单核苷酸的毛细管区带电泳分离分析进行了报道。
1。5 核苷酸的生产应用
1。5。1 核苷酸生产方法概况
目前已经有多种方法可生产核苷酸及其衍生物。归纳起来，主要有以下三种:化学合成法、微生物发酵法及提取法。三种方法生产的工艺及产品均有很大的差别。
1。5。1。1 化学合成法
主要是利用核苷进行磷酸酯化反应，在要得到的核苷的5’-位上导入磷酸基而得到目的核苷酸。常用的磷酸化试剂为磷酸或者焦磷酸的活性衍生物，工业上多用三氯氧化磷。目前化学法合成核苷酸的收率为85%左右。化学法合成法按照反应条件不同可以再细分为:ott法、ludwig法、其它方法。化学合成核苷酸的方法由于所用的试剂较贵、有毒性，生产成本比较高，仅用于一些特殊用途的5’-核苷酸及其衍生物的合成，目前仅用在实验室规模。
1。5。1。2 微生物发酵法生产5’-核苷酸
微生物发酵法生产5’-核苷酸目前已有生产规模，但不是所有的5’-核苷酸都可以用微生物发酵法来生产，目前只有几种核苷酸可行。
肌苷的生产工业流程:斜面种子种子罐培养发酵发酵液调ph阳性树脂吸附水洗活性碳吸附碱洗脱一次浓缩过滤二次浓缩冷冻结晶抽滤干燥精制肌苷成品
鸟苷酸(gmp)的生产原理:鸟苷酸和腺苷酸都是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，鸟苷酸在菌体内的浓度超过一定限度，就会引起反馈调节，抑制鸟苷酸自身的合成。同时，鸟苷的溶解度很低，在发酵时容易析出结晶，也可以减弱反馈调节作用，积累鸟苷。
1。5。1。3 提取法
在菌体内rna含量的变化受培养基组成影响。通常细菌中含rna5%～25%，酵母中含2。7%～15%，霉菌含0。7%～28%，面包酵母含rna4。1%～7。2%。其中由于酵母体内的rna/dna含量最高，且培养酵母菌体的收率高，并且生产上存在大量废酵母，故目前多用酵母菌体来提取核苷酸。
1。5。2 核苷酸的应用
1。5。2。1 核苷酸的功能
核苷酸在生物体内具有多种生物学功能，在维持细胞能量调节等方面有着重要的作用。在体内，作为核酸的基本组成单位，核苷酸的多少直接影响细胞rna和dna的合成水平，从而影响到机体的各种生理功能。核苷酸具有免疫调节功能，核苷酸对机体的肝脏、小肠等器官组织也有很明显的影响，对于肝部有疾病的人来讲，补充核苷酸是有力的，有实验证实了对于象肠胃道这样增生较快的组织，提高体内核苷酸水平有利于这些组织的正常发育、成熟和修补。在生物体内，核苷酸存在于所有细胞中，它们可以作为机体的能量来源，作为激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物、磷脂合成的重要中介物，作为甲基和硫酸盐的供体，是各种代谢途径起关键作用的辅酶的重要组成成分，作为变构效应因子可以控制体内许多重要代谢途径的调节步骤，是机体生命活动的基础。
1。5。2。2 核苷酸的用途
核酸类物质已用于各种医疗方面，作为重要的医药中间体，核糖核酸降解后得到的核苷酸、核苷及碱基都是用途广泛的药物，它们的衍生物在抗肿瘤和抗病毒方面的应用则更为显著。腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、胞二磷胆碱、核苷三磷酸等核酸的有关组分及衍生物，是天然的代谢激活剂，有助于改善机体的物质代谢和能量代谢，加速受损组织的修复，促使病态细胞、缺氧组织恢复正常生理功能。腺苷酸是体内能量传递物质，比腺三磷稳定，具有显著的扩张血管和降压作用，适用于肝病、瘙痒、静脉曲张性溃疡并发症。天然的黄嘌呤类似物有兴奋中枢神经系统的作用，其作用的主要部位是大脑。5’-氟尿嘧啶为尿嘧啶抗代谢物，在体内转变成5’-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷酸，抑止胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变成为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，从而影响dna的生物合成，抑制肿瘤细胞的生长增殖[5]。
5’-gmp和5’-imp与味精调合使用具有显著的鲜味相乘效应，且风味更佳，还可与经过特殊工艺加工的动物蛋白和植物蛋白及多种氨基酸混合，调配各种风味的特鲜味精等调味品，因此利用微生物发酵法生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。欧洲已经发表有关添加nt奶粉指导方针，欧洲、美国、日本、韩国等市场已销售添加核酸和nt的奶粉。母乳内含有较多的核酸，而原来普通奶粉大多数不含核酸。婴儿饮用奶粉常常会有先天过敏症，而且对抗感染能力也较弱，主要原因是奶粉中缺少核酸之故。为了使以牛奶为基础的代乳品更加接近人乳，将核苷酸添加到以牛奶为基础的代乳品中，对婴幼儿的胃肠道发育、胃肠道健康的维持以及血浆脂蛋白的组成都有有利的影响[6]。核苷酸通过改善每一细胞的活力而提高机体各系统的自身功能和自我调节能力，来达到最佳综合状态和生理平衡，因此具有广泛而稳定的营养保健作用。核苷酸添加于保健品中，对促进儿童的生长发育，增强智力，提高成年人的抗病抗衰老能力及手术病人的身体康复均有显著作用，特别对老年人效果更佳。
1。6 本文的研究目的和内容
从以上的综述中可以看到，核苷酸作为基础性原料，应用领域很广。尤其是在医药行业上，除了自身可以作为药物使用外，还是合成许多新型抗病毒、抗肿瘤、抗癌药物的原料。新的核苷酸的相关衍生物也不断涌现，这些药物有望成为解决目前一些疑难杂症的新型药物。因此彻底解决核苷酸的大规模生产问题，解决这一基础性原料的短缺显得尤为重要。
1。6。1 本文研究的目的
虽然酶解法生产四种核苷酸有很大的优越性，但是，该方法中存在着原料质量差、酶活底、酶解不彻底等问题。针对上述问题本文研究的目的是如何从rna中水解得到更多的核苷酸，以及如何从麦芽根中提取更多的酶。主要有:1，研究从麦芽根中提取核酸酶最佳的提取条件，更多的从麦芽根中提取核酸酶。2，研究水解rna最佳的水解条件，尽可能提高水解后核苷酸的量。
1。6。2 本文的主要内容
1。6。2。1 麦芽根中核酸酶的提取
1研究在不同加水比、ph值、温度、时间等条件下酶的活力大小。
2酶活的测定，采用紫外分光光度计法。
1。6。2。2 水解rna条件的研究
1用从麦芽根中提取的核酸酶水解rna，研究不同底物浓度、加酶量、ph值、温度、时间等条件下水解率的高低。
2用发酵酶液水解rna，研究不同因素水平下水解率的高低。
个最适条件，由于核酸酶的不同，核酸酶在水解核酸时的条件也不相同，所以在已知核糖核酸酶的大体反应条件的情况下，在各条件的附近设计不同水平的正交实验方案。根据不同因素不同水平选用不同的正交实验表，应用正交实验表上的各因素的组合进行实验得出数据，作出各因素的曲线图，若不能确定该因素的最适水平，再继续作未得出结果因素的正交实验，直到得出最适条件。将水解产物加沉淀剂沉淀离心，取上清液，用紫外分光光度计法测260nm处的紫外吸收值。同时用发酵得到的酶液进行正交实验设计，方法与提取酶液水解方法相同。
1。4 核苷酸的结构性质与检测
1。4。1 核苷酸的结构性质
核苷酸是核酸的组成单位，它由三部分组成，分别为磷酸、戊糖和碱基。核苷酸按戊糖的种类不同，可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种，其中核糖核苷酸是rna的组成单位，而脱氧核糖核苷酸则是dna的组成单位。组成rna的核糖核苷酸按照核苷酸分子碱基的不同，核苷酸可以分成四种，即5’-腺嘌呤核苷酸（amp）、5’-鸟嘌呤核苷酸(gmp)，5’-胞嘧啶核苷酸(cmp)和5’-尿嘧啶核苷酸(ump)。
5’-腺嘌呤核苷酸（5’-amp）分子量347。22，自丙酮水溶液中可得含有两分子水的结品。溶于热水，pk3。8(碱性基团)<1，6。2-6。4(磷酸根)。
5’-鸟嘌呤核苷酸（5’-gmp:）分子量363。23，含1/2分子水的结品，pk2。4(碱性基团)、9。4(酸性基团)<1，6。1(磷酸根)。熔点190-200c(分解)。
5’-尿嘧啶核苷酸（5’-ump）分子量324。18，pk9。5(碱基上酸性基团)<1，6。4(磷酸根)。
5’-胞嘧啶核苷酸（5’-cmp)分子量323。21，熔点233c(分解)。pk4。5(碱性基团)<1，6。3(磷酸根)。
四种核苷酸的结构式如下图所示:
实际使用中，四种核苷酸主要以钠盐形式存在。其形态均为无色至自色结晶或白色结晶性粉末，在保藏和应用中多为核苷酸的二钠盐。
1。4。2 核苷酸的检测
核酸水解产物核苷酸、核苷和碱基的分析方法，主要有光谱法（紫外光吸收法）、质谱法、色谱法（高效液相色谱法、离子色谱、反相高效液相色谱（rp-hplc）、薄层色谱）、电泳法（毛细管电泳）等。其中毛细管电泳和高效液相色谱法的分离能力最强，在细胞分离方面有广泛的用途，尤其是高效液相色谱法（hlpc）应用很多，紫外光吸收法应用方便，但准确率不高。离子交换液相色谱法具有较高的分离效率，但是需要对分离柱进行再生，分析的时间较长；反相液相色谱法具有快速、操作方便的特点，现有离子对反相和常规反相色谱，洗脱方法可采用等度洗脱，也可采用梯度洗脱。目前有许多关于核苷酸检测这方面的报道:张志国，贾云虹等用hplc和紫外检测方法对乳粉中的四种核苷酸cmp、ump、amp、gmp含量进行了检测，采用c-18柱，据报道结果完全符合要求。吉琼梅等人用0。05mol/l的kh2po4为流动相的高效液相色谱法测定了棉宝中的5’-amp、5’-cmp、5’-gmp、5’-ump的分解率。黄晓兰、李科德和陈云华报道采用反相高效液相色谱可以分离15种核酸的水解产物，并介绍了该方法在酵母抽提物中的应用。霍小敏、屠春燕等人用反规液相色谱和梯度洗脱模式对酵母rna降解的4中核苷酸进行了分离和检测。郑理、朱怀恩等人用紫外光吸收法对保健品中的核酸含量进行了测定[7]。邹耀洪、曹学增等对以hplc（高效液相色谱）与lc/ms(质谱)复合定性蘑菇柄中的5’-核苷酸进行了报道。韩凤梅、杨新等人对四种单核苷酸的毛细管区带电泳分离分析进行了报道。
1。5 核苷酸的生产应用
1。5。1 核苷酸生产方法概况
目前已经有多种方法可生产核苷酸及其衍生物。归纳起来，主要有以下三种:化学合成法、微生物发酵法及提取法。三种方法生产的工艺及产品均有很大的差别。
1。5。1。1 化学合成法
主要是利用核苷进行磷酸酯化反应，在要得到的核苷的5’-位上导入磷酸基而得到目的核苷酸。常用的磷酸化试剂为磷酸或者焦磷酸的活性衍生物，工业上多用三氯氧化磷。目前化学法合成核苷酸的收率为85%左右。化学法合成法按照反应条件不同可以再细分为:ott法、ludwig法、其它方法。化学合成核苷酸的方法由于所用的试剂较贵、有毒性，生产成本比较高，仅用于一些特殊用途的5’-核苷酸及其衍生物的合成，目前仅用在实验室规模。
1。5。1。2 微生物发酵法生产5’-核苷酸
微生物发酵法生产5’-核苷酸目前已有生产规模，但不是所有的5’-核苷酸都可以用微生物发酵法来生产，目前只有几种核苷酸可行。
肌苷的生产工业流程:斜面种子种子罐培养发酵发酵液调ph阳性树脂吸附水洗活性碳吸附碱洗脱一次浓缩过滤二次浓缩冷冻结晶抽滤干燥精制肌苷成品
鸟苷酸(gmp)的生产原理:鸟苷酸和腺苷酸都是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，鸟苷酸在菌体内的浓度超过一定限度，就会引起反馈调节，抑制鸟苷酸自身的合成。同时，鸟苷的溶解度很低，在发酵时容易析出结晶，也可以减弱反馈调节作用，积累鸟苷。
1。5。1。3 提取法
在菌体内rna含量的变化受培养基组成影响。通常细菌中含rna5%～25%，酵母中含2。7%～15%，霉菌含0。7%～28%，面包酵母含rna4。1%～7。2%。其中由于酵母体内的rna/dna含量最高，且培养酵母菌体的收率高，并且生产上存在大量废酵母，故目前多用酵母菌体来提取核苷酸。
1。5。2 核苷酸的应用
1。5。2。1 核苷酸的功能
核苷酸在生物体内具有多种生物学功能，在维持细胞能量调节等方面有着重要的作用。在体内，作为核酸的基本组成单位，核苷酸的多少直接影响细胞rna和dna的合成水平，从而影响到机体的各种生理功能。核苷酸具有免疫调节功能，核苷酸对机体的肝脏、小肠等器官组织也有很明显的影响，对于肝部有疾病的人来讲，补充核苷酸是有力的，有实验证实了对于象肠胃道这样增生较快的组织，提高体内核苷酸水平有利于这些组织的正常发育、成熟和修补。在生物体内，核苷酸存在于所有细胞中，它们可以作为机体的能量来源，作为激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物、磷脂合成的重要中介物，作为甲基和硫酸盐的供体，是各种代谢途径起关键作用的辅酶的重要组成成分，作为变构效应因子可以控制体内许多重要代谢途径的调节步骤，是机体生命活动的基础。
1。5。2。2 核苷酸的用途
核酸类物质已用于各种医疗方面，作为重要的医药中间体，核糖核酸降解后得到的核苷酸、核苷及碱基都是用途广泛的药物，它们的衍生物在抗肿瘤和抗病毒方面的应用则更为显著。腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、胞二磷胆碱、核苷三磷酸等核酸的有关组分及衍生物，是天然的代谢激活剂，有助于改善机体的物质代谢和能量代谢，加速受损组织的修复，促使病态细胞、缺氧组织恢复正常生理功能。腺苷酸是体内能量传递物质，比腺三磷稳定，具有显著的扩张血管和降压作用，适用于肝病、瘙痒、静脉曲张性溃疡并发症。天然的黄嘌呤类似物有兴奋中枢神经系统的作用，其作用的主要部位是大脑。5’-氟尿嘧啶为尿嘧啶抗代谢物，在体内转变成5’-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷酸，抑止胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变成为胸腺嘧啶脱氧核苷酸，从而影响dna的生物合成，抑制肿瘤细胞的生长增殖[5]。
5’-gmp和5’-imp与味精调合使用具有显著的鲜味相乘效应，且风味更佳，还可与经过特殊工艺加工的动物蛋白和植物蛋白及多种氨基酸混合，调配各种风味的特鲜味精等调味品，因此利用微生物发酵法生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。欧洲已经发表有关添加nt奶粉指导方针，欧洲、美国、日本、韩国等市场已销售添加核酸和nt的奶粉。母乳内含有较多的核酸，而原来普通奶粉大多数不含核酸。婴儿饮用奶粉常常会有先天过敏症，而且对抗感染能力也较弱，主要原因是奶粉中缺少核酸之故。为了使以牛奶为基础的代乳品更加接近人乳，将核苷酸添加到以牛奶为基础的代乳品中，对婴幼儿的胃肠道发育、胃肠道健康的维持以及血浆脂蛋白的组成都有有利的影响[6]。核苷酸通过改善每一细胞的活力而提高机体各系统的自身功能和自我调节能力，来达到最佳综合状态和生理平衡，因此具有广泛而稳定的营养保健作用。核苷酸添加于保健品中，对促进儿童的生长发育，增强智力，提高成年人的抗病抗衰老能力及手术病人的身体康复均有显著作用，特别对老年人效果更佳。
1。6 本文的研究目的和内容
从以上的综述中可以看到，核苷酸作为基础性原料，应用领域很广。尤其是在医药行业上，除了自身可以作为药物使用外，还是合成许多新型抗病毒、抗肿瘤、抗癌药物的原料。新的核苷酸的相关衍生物也不断涌现，这些药物有望成为解决目前一些疑难杂症的新型药物。因此彻底解决核苷酸的大规模生产问题，解决这一基础性原料的短缺显得尤为重要。
1。6。1 本文研究的目的
虽然酶解法生产四种核苷酸有很大的优越性，但是，该方法中存在着原料质量差、酶活底、酶解不彻底等问题。针对上述问题本文研究的目的是如何从rna中水解得到更多的核苷酸，以及如何从麦芽根中提取更多的酶。主要有:1，研究从麦芽根中提取核酸酶最佳的提取条件，更多的从麦芽根中提取核酸酶。2，研究水解rna最佳的水解条件，尽可能提高水解后核苷酸的量。
1。6。2 本文的主要内容
1。6。2。1 麦芽根中核酸酶的提取
1研究在不同加水比、ph值、温度、时间等条件下酶的活力大小。
2酶活的测定，采用紫外分光光度计法。
1。6。2。2 水解rna条件的研究
1用从麦芽根中提取的核酸酶水解rna，研究不同底物浓度、加酶量、ph值、温度、时间等条件下水解率的高低。
2用发酵酶液水解rna，研究不同因素水平下水解率的高低。